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扩增子分析解读5物种注释

本节课程,需要先完成《扩增子分析解读》系列之前的操作

1质控 实验设计 双端序列合并

2提取barcode 质控及样品拆分 切除扩增引物

3格式转换 去冗余 聚类

4去嵌合体 非细菌序列 生成代表性序列和OTU表

分析前准备

# 进入工作目录
cd example_PE250

上一节回顾:我们学习了嵌合体的形成,以及基于参考数据库去嵌合体;也学习了基于数据库比对来筛选细菌或真菌;最后基于最确定的OTU,我们生成代表性序列和OTU表,这是每种高通量测序都有的结果,后续的结果将全部基于这两个文件。

 

接下来我们学习对OTU进行物种注释;OTU的操作,包括格式转换、筛选添加物种信息、数据量筛选样品、筛选高丰度的OTU、物种筛选等。

 

OTU表常用的BIOM格式

主页: 。BIOM是英文The Biological Observation Matrix的缩写,中文翻译为生物观测矩阵,是一种通过格式,用于生物学样品对应观测值的表格。它主要采用json/HD5F文件格式标准,即多维散列结构,保存表格结构数据结果。目前主流的宏基因组软件均支持此格式文件,如QIIME、MG-RAST、PICRUSt、Mothur、phyloseq、MEGAN、VAMPS、metagenomeSeq、Phinch、RDP Classifier、USEARCH、PhyloToAST、EBI Metagenomics、GCModeller、MetaPhlAn 2。知道它有多重要了吧。

 

Biom文件处理系统biom程序是QIIME的必装包,如果没有安装好,可尝试下面步骤重装

# 安装依赖包
pip install numpy
# 安装biom格式转换包
pip install biom-format
# 安装2.0格式支持
pip install h5py
# 测序程序是否安装成功
biom
  1. 物种注释

对于扩增子分析,最重要的就是物种信息。我们基于上节分析得到的代表性序列,采用上次已经下载的greengene的参考序列和物种注释信息,比对软件选择rdp方法,进行注释。

# 物种注释
assign_taxonomy.py -i result/rep_seqs.fa 
 -r gg_13_8_otus/rep_set/97_otus.fasta 
 -t gg_13_8_otus/taxonomy/97_otu_taxonomy.txt 
 -m rdp -o result

注:如果是ITS/18S数据,建议数据库更改为UNITE,方法改为blast。详细使用说明,请读官方文档

 

  1. OTU表统计、格式转换、添加信息

将OTU表转换为Biom格式,这样便于其它软件对其操作。可添加上面获得的物种信息,这样表格的信息就更丰富了,再转换为文本,便于人类可读,同时使用summarize-table查看OTU表的基本信息。

# 文本OTU表转换为BIOM:方便操作
biom convert -i temp/otu_table.txt 
 -o result/otu_table.biom 
 --table-type="OTU table" --to-json
# 添加物种信息至OTU表最后一列,命名为taxonomy
biom add-metadata -i result/otu_table.biom 
 --observation-metadata-fp result/rep_seqs_tax_assignments.txt 
 -o result/otu_table_tax.biom 
 --sc-separated taxonomy --observation-header OTUID,taxonomy 
# 转换biom为txt格式,带有物种注释:人类可读
biom convert -i result/otu_table_tax.biom -o result/otu_table_tax.txt --to-tsv --header-key taxonomy
# 查看OTU表的基本信息:样品,OUT数量统计
biom summarize-table -i result/otu_table_tax.biom -o result/otu_table_tax.sum

现在我们获得了OTU表的基本统计信息,用less result/otu_table_tax.sum查看一下吧,内容如下:

Num samples: 27 # 样品数据

Num observations: 975 # OTU数据

Total count: 409647 # 总数据量

Table density (fraction of non-zero values): 0.464 # 非零的单元格

 

Counts/sample summary:

 Min: 2352.0 # 样品数据量最小值

 Max: 35955.0 # 样品数据量最大值

 Median: 14851.000 # 样品数据量中位数

 Mean: 15172.111 # 样品数据量平均数

 Std. dev.: 10691.823 # 样品数据量标准变异

 Sample Metadata Categories: None provided # 样品分类信息:末提供

 Observation Metadata Categories: taxonomy # 观察值分类:物种信息

 

Counts/sample detail: # 每个样品的数据量

OE4: 2352.0

OE3: 2353.0

OE8: 3091.0

OE2: 3173.0

OE1: 3337.0

OE5: 3733.0

OE6: 4289.0

OE9: 4648.0

OE7: 5185.0

WT3: 10741.0

WT8: 12117.0

WT6: 14316.0

WT2: 14798.0

WT7: 14851.0

KO1: 14926.0

WT9: 15201.0

WT1: 15422.0

WT5: 15773.0

WT4: 16708.0

KO2: 17607.0

KO6: 23949.0

KO5: 26570.0

KO8: 27250.0

KO4: 32303.0

KO7: 33086.0

KO9: 35913.0

KO3: 35955.0

biom的详细使用说明,可以biom查看具体的功能,如添加注释功能biom add-metadata --help可查看详细说明。也可阅读官网

 

  1. OTU表筛选

实验中会有各种影响因素,我们要综合各种背景知识来判断如何筛选数据表,起到去伪存真,去粗取粗,由此及彼,有表及理的来回答科学问题。数据筛选是会运行分析流程和数据分析师的分水岭。

 

看上面的的统计结果,样本数据量从2k-35k,我们应去除过小的数据量样本,提供更可能高的样品最低丰度的数据用于下游标准化分析。这里我们选择只保留数据量大于3000的样品。

# 按样品数据量过滤:选择counts>3000的样品
filter_samples_from_otu_table.py -i result/otu_table_tax.biom -o result/otu_table2.biom -n 3000
# 查看过滤后结果:只有25个样品,975个OTU
biom summarize-table -i result/otu_table2.biom

同时还要过滤低丰度的OTU,一般低于万分之一丰度的菌,在功能研究可能还是比较困难的(早期文章454测序数据量少,通常只关注丰度千分之五以上的OTU)。

# 按OTU丰度过滤:选择相对丰度均值大于万分之一的OTU
filter_otus_from_otu_table.py --min_count_fraction 0.0001 -i result/otu_table2.biom -o result/otu_table3.biom
# 查看过滤后结果:只有25个样品,346个OTU
biom summarize-table -i result/otu_table3.biom

有些研究手段在特定有实验中存在偏差,如2012Nature报导V5-V7在植物中扩增会偏好扩增Chloroflexi菌门,建议去除。

# 按物种筛选OTU表:去除p__Chloroflexi菌门
filter_taxa_from_otu_table.py -i result/otu_table3.biom -o result/otu_table4.biom -n p__Chloroflexi
# 查看过滤后结果:只有25个样品,307个OTU
biom summarize-table -i result/otu_table4.biom

以上过滤条件是根据经验、相关文献设计的,如果不清楚,也不要随便过滤,容易引起假阴性。

 

得到的最终结果,还要转换为文本格式,和提取OTU表对应的序列,用于下游分析。

# 转换最终biom格式OTU表为文本OTU表格
biom convert -i result/otu_table4.biom -o result/otu_table4.txt --table-type="OTU table" --to-tsv
# OTU表格式调整方便R读取
sed -i '/# Const/d;s/#OTU //g;s/ID.//g' result/otu_table4.txt
# 筛选最终OTU表中对应的OTU序列
filter_fasta.py -f result/rep_seqs.fa -b result/otu_table4.biom -o result/rep_seqs4.fa

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